תגובת חיתוך דנ"א במבחנה (In vitro DNA digestion):

• המרכיבים הנדרשים לתגובה:
  1. דנ"א: המקטע שאנו רוצים לחתוך.
  2. אנזים רסטריקציה: למשל EcoRI.
  3. באפר: מספק את הסביבה הכימית הנדרשת לאנזים (רמת חומציות (pH), מליחות). לרוב מגיע בריכוז של 10x ויש לדלל אותו ל-1x.
  4. מים מזוקקים פעמיים (ddw): מים נטולי מלחים שעלולים להפריע לריאקציה.
• הטמפרטורה נקבעת ספציפית לפי סוג האנזים שבו משתמשים (לדוגמה, רובם עובדים ב-37°C).

חיבור דנ"א - ליגציה (DNA Ligation):

• חיבור קוולנטי של שני מקטעי דנ"א לאחר החיתוך בעזרת אנזים הדנ"א ליגאז.
• האנזים יוצר קשר פוספודיאסטרי בין קבוצת ה-3'-OH של נוקלאוטיד אחד לבין קבוצת ה-5'-פוספט של הנוקלאוטיד השני.
• המרכיבים הנדרשים לריאקציה:
  הרצאה 7 - מניפולציות דנא 1. דנ"א (המקטעים לחיבור)
  1. אנזים (T4 Ligase)
  2. באפר ייעודי
  3. מולקולת ATP
  4. מים מזוקקים פעמיים.
• מדוע צריך ATP:
  • הליגאז דורש אנרגיה ליצירת הקשר הקוולנטי.
  • ה-ATP נקשר לחומצת אמינו (ליזין) באנזים ומספק את האנרגיה הזו (פירוק ה-ATP לפוספט).
• הטמפרטורה האופטימלית לליגציה:
  • לרוב מבוצעת ב-16°C.
  • במעבדה משיגים זאת על ידי מכשיר PCR, קירור למקרר (4°C) או הנחה בקרח שנמס במהלך הלילה.

אנזים T4 PNK (Polynucleotide Kinase) ושיטת EMSA:

• תפקיד ה-PNK:
  • מוסיף קבוצת פוספט לקצה ה-5' של הדנ"א. זה הכרחי אם אנחנו מנסים לחבר תוצרי PCR שעברו הגברה, כיוון שתוצרי PCR טבעיים הם מחוסרי קבוצת הפוספט ב-5' שדרושה לליגאז.
  • גילוי הרדיואקטיביות על ידי מארי קירי מנוצל בביולוגיה מולקולרית – ניתן להשתמש ב-PNK כדי להוסיף פוספט רדיואקטיבי וכך "לסמן" דנ"א.
• שיטת EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay):
  • משתמשת בדנ"א מסומן כזה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-דנ"א (כמו פקטור שעתוק שנקשר לפרומוטר).
  • אם חלבון נקשר למקטע הדנ"א, הוא ייצור קומפלקס כבד שינוע לאט יותר בג'ל לעומת דנ"א נקי, מה שייצור תזוזה.

שיטת חיבור גיבסון (Gibson Assembly):

• שיטה מודרנית, מהירה ויעילה לחיבור מספר רב של מקטעי דנ"א בתוך מבחנה אחת ללא שימוש באנזימי רסטריקציה.
• אופן הפעולה: משתמשים בפריימרים מיוחדים שמייצרים תוצרי PCR עם קצוות חופפים (הומולוגיים) של 20-40 בסיסים.
• במבחנה מתרחשים 3 שלבים במקביל ב-50°C:
  • שלב 1 - T5 Exonuclease:
    • "אוכל" בחזרה (מעכל) את קצוות ה-5' ויוצר קצוות "דביקים" ארוכים מאוד וספציפיים שנקשרים זה לזה.
    • בטמפרטורה של 50°C, האנזים עובר דנטורציה ונהרס לאחר זמן קצר, מה שמונע ממנו להרוס את כל הדנ"א.
  • שלב 2 - DNA Polymerase:
    • משלים וסוגר את הרווחים במקומות בהם האקסונוקלאז אכל מעט יותר מידי.
  • שלב 3 - DNA Ligase:
    • אוטם את הנתקים שנותרו ליצירת מולקולה אחת רציפה.
• 

רוורס טרנסקריפטאז (Reverse Transcriptase - RT):

• בגוף החי, הדוגמה המרכזית היא שדנ"א הופך לרנ"א (שעתוק) והרנ"א הופך לחלבון (תרגום). אנזים ה-RT עושה פעולה הפוכה לטבע - הוא הופך רנ"א בחזרה לדנ"א.
• האנזים התגלה בווירוסים מסוג רטרו-וירוס, שמשתמשים בו כדי להמיר את הגנום הרנ"אי שלהם לדנ"א על מנת לחדור לגנום התא המאכסן.

היברידיזציה באתרה (In Situ Hybridization - ISH):

• שיטה המשמשת לאיתור וזיהוי של המיקום המדויק בו מולקולת mRNA מסוימת מתבטאת בתוך תאים או רקמות שלמות (Whole mount).
• בניגוד לנוגדנים שמאתרים חלבונים, בשיטה זו מחדירים פרוב (Probe) של דנ"א קומפלמנטרי מסומן (למשל פלואורסצנטית או עם חומר צבע) לתוך התא.
• הפרוב ייקשר רק ל-mRNA התואם לו, וכך ניתן לראות צבע באזור שבו הגן פעיל (למשל, זיהוי ביטוי של גן ספציפי בעובר של דג).